單細胞Plus是結合單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）與單細胞核轉錄組測序（snRNA-seq），兼顧兩者優勢，相得益彰，從而揭示更系統全面、深入精準的生物學機制的研究方法。下面通過幾個典型文獻案例來為您揭曉其中的緣由與奧秘。
生命現象的本質是復雜的細胞互作網絡，類型各異的細胞相互通訊并執行特定功能，從而展現出豐富多彩的生理活動或狀態各異的病理活動。單細胞測序，特別是單細胞轉錄組檢測，通過在分子網絡層面解析和鑒定細胞功能，回溯和還原組織內部的細胞網絡，明確細胞的分子調控模式和狀態變化，從而洞察生命現象背后的機制，業已成為生命科學研究中最強有力的技術手段。
(資料圖)
由于技術上的限制，scRNA-seq（這里特指使用完整細胞進行的檢測）會造成細胞類型偏好性、應激基因偏好等缺陷，因此，學界轉而利用snRNA-seq來避免這些不足。但snRNA-seq通常檢測到的是組織中占有優勢比例的細胞類型，例如心臟組織中大量獲得的是心肌細胞，腦組織中獲得的是神經元等等，這對一些課題造成了阻礙，例如更多關注免疫細胞功能的研究，因為很難捕獲這些細胞類型而無法進行深入的分析。
基于各自技術的優勢與劣勢，目前學界逐步開始采用scRNA-seq與snRNA-seq結合的方式（我們稱之為單細胞Plus）來開展單細胞的轉錄組研究，取得了很好的效果，具體體現在以下三個方面：
“應有盡有”
細胞Plus最直觀的優點，就是獲得的細胞圖譜更完整，細胞類型應有盡有。例如在人類脂肪組織的研究中，snRNA-seq補充了Adipocyte、Mesothelium，并獲得了更多的細胞數量【1】（圖1）。同樣的，在心臟組織中，snRNA-seq捕獲了Endocardium、Cardiomyocytes等scRNA-seq缺少的細胞類型，使細胞圖譜更加完整和全面【2】（圖2）。而在肝臟中也取得了同樣的良好效果【3】。因此，單細胞Plus能夠解決scRNA-seq長期存在的細胞偏好性問題，收獲更全面、更系統的細胞圖譜。
另外，單細胞Plus更有助于挖掘稀有細胞類型或細胞亞型，例如對脂肪細胞不同亞型與各項疾病或身體指標的關聯性分析，揭示了占比較少的細胞亞型與二型糖尿病高度相關【1】（圖3）。通過這種“細致入微”的檢測與分析，單細胞Plus能夠解答更多樣、更深入的生物學問題，并揭示其背后的分子機制，為高水平研究奠定了堅實的基礎。
圖1??人類脂肪組織單細胞Plus圖譜
scRNA-seq與snRNA-seq的結合在脂肪組織中捕獲了更為完整的細胞類型。引自【1】。
圖2??人類心臟組織單細胞Plus圖譜
scRNA-seq與snRNA-seq的結合在心臟組織中揭示了更豐富的細胞類型。引自【2】。
圖3??人類白色脂肪細胞各亞型與不同疾病或身體指標之間的相關性分析
對白色脂肪細胞的獨立分析顯示其可以進一步劃分為7個亞型，其中hAd7亞型與二型糖尿病高度相關，能夠顯著影響患病風險，盡管其數量僅占所有脂肪細胞的1%。引自【1】。
“洞察新機”
除了獲得更全面的細胞圖譜，借助分析scRNA-seq與snRNA-seq轉錄組的異同，單細胞Plus還能揭示全新的細胞調控機制。
在對果蠅精細胞發育的研究中，作者基于已知的干細胞會在細胞質中儲存部分RNA，從而影響子代細胞分化的現象，通過對比scRNA-seq與snRNA-seq中轉錄本的異同，揭示了特定基因在精細胞發育過程中所扮演的特異性的調控作用【4】（圖4）。類似的，在對蜘蛛胚胎的分析中，作者對比scRNA-seq數據，在snRNA-seq中鑒定到了獨特的細胞類群，進一步的分析表明這個類群代表了細胞分化的一個過渡狀態，這樣就在整體上更加“動態”的解析了胚胎細胞的發育軌跡【5】（圖5）。
這些基因的鑒定及其所“預示”的分子機制，為我們理解細胞命運分化、功能改變等提供了全新的視角，相比單獨采用scRNA-seq或snRNA-seq，能夠獲得更多不同層面的細胞調控機制。因此，在單細胞轉錄組研究越來越多的當下，單細胞plus能夠帶來更多差異化的創新點，拓寬課題探索的范圍，增加研究的深度，幫助我們取得更新穎和更廣泛的突破。
圖4??單細胞Plus解析干細胞分化的調控基因
熱圖展示了隨著細胞分化的進行（圖片上部橫軸顯示的時期），同樣的基因在scRNA-seq與snRNA-seq數據中擁有不同的表達模式，提示這些基因在細胞分化過程中可能被儲存在細胞質中以調控分化進程：如下半部分的warped?pseudotime圖示。引自【4】。（注：因圖片過大，熱圖僅展示了一部分）。
圖5??單細胞Plus揭示更細致的細胞狀態變化
通過scRNA-seq與snRNA-seq的對比揭示了更為動態的圖譜變化：snRNA-seq中cluster?9是外胚層細胞（mesodermal cell）的一種終末分化類群（posterior terminal cell population），暗示了一種正在出現的細胞狀態（emerging cell states）。引自【5】。
“因勢利導”
隨著成本的降低和數據的積累，單細胞轉錄組測序已經成為生命科學研究的“常規工具”，未來的研究將越來越追求更全面、更深入、更豐富的細胞調控機制。從技術角度來說，單細胞Plus很好的貼合了這一趨勢，能夠幫助我們獲得更加系統的洞見。而從最“直觀”的邏輯角度來看，更多的細胞數量，意味著更多的生物學“故事”。因此，單細胞Plus將成為未來單細胞組學研究的重要方法。
例如近期的植物學研究，也開始采用單細胞Plus的方式【6】（圖6），通過scRNA-seq提供的深度以及snRNA-seq揭示的廣度，以纖毫畢現的精度展示了玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、狗尾草（Setaria viridis）三種植物的單細胞分辨率的泛轉錄組（pan-grass?transcriptome），為研究植物進化提供了更系統、更精準的圖譜，并為育種、作物改良等帶來了全新的見解與思路。
圖6??玉米根的單細胞Plus圖譜
scRNA-seq提供了深度，snRNA-seq揭示了廣度，匯總成了更系統的圖譜。引自【6】
參考文獻
1.A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 2022 Mar;603(7903):926-933
2.Single-cell transcriptomics reveals cell-type specific diversification in human heart failure.?Nat Cardiovasc Res. 2022 Mar;1(3):263-280
3.Single-Cell, Single-Nucleus, and Spatial RNA Sequencing of the Human Liver Identifies Cholangiocyte and Mesenchymal Heterogeneity. Hepatol Commun. 2022 Apr;6(4):821-840.
4.Emergent dynamics of adult stem cell lineages from single nucleus and single cell RNA-Seq of Drosophila testes. Elife. 2023 Feb 16;12:e82201
5.Reconstruction of the Global Polarity of an Early Spider Embryo by Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptome Analysis. Front Cell Dev Biol. 2022 Jul 22;10:933220.
6.A pan-grass transcriptome reveals patterns of cellular divergence in crops. Nature. 2023 May;617(7962):785-791.
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